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巨噬細胞炎性蛋白2Elisa試劑盒操作步驟和注意事項

點擊次數(shù):1145 更新時間:2017-01-21

巨噬細胞炎性蛋白2Elisa試劑盒操作步驟和注意事項

方法一 巨噬細胞炎性蛋白2Elisa試劑盒用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1、 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml.在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

2、 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

3、 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml.37℃ 孵育0.5~1小時,洗滌。

4、 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。

5、 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml.

6、 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強,陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

噬細胞炎性蛋白2Elisa試劑盒試劑器材

1、 試劑

(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

NaHCO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS):0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0、2克

Tween-20 0.05% 0.5ml

加蒸餾水至1000ml

(3) 稀釋液:

牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

加洗滌緩沖液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5~10%使用。

(4) 終止液(2M H2SO4):

蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml.

(5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml

0.1M 檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml

加蒸餾水50ml。

(6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:

TMB(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml

底物緩沖液(PH5.5) 10ml

0.75%H2O2 32μl

(7) ABTS使用液:

ABTS 0.5mg

底物緩沖液(PH5.5) 1ml

3%H2O2 2μl

(8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

(9) 正常人血清和陽性對照血清。

2、 器材:

(1) 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔,ELISA檢測儀,50μl及100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。

(2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。

噬細胞炎性蛋白2Elisa試劑盒注意事項

1、 正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2、 在ELISA中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:

(1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

(2) 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml.

(3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

(4) 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。

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