泰澤隱孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒實驗規(guī)則
泰澤隱孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒實驗規(guī)則：
1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時。
3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4、實驗時，要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。
6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。
7、將液體加到酶標(biāo)孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。
8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動功能。
9、應(yīng)盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
10、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。
?為確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性，實驗人員需嚴(yán)格遵守以下補充操作規(guī)范：
11. 反應(yīng)板密封時需使用光學(xué)級封板膜，避免PCR反應(yīng)過程中蒸發(fā)導(dǎo)致體系濃度變化。封膜前應(yīng)檢查孔邊緣有無液體殘留，防止交叉污染。
12. 擴(kuò)增程序設(shè)置時需進(jìn)行溫度校準(zhǔn)，建議使用第三方溫度驗證儀對PCR儀各孔位進(jìn)行梯度檢測，溫差應(yīng)控制在±0.3℃范圍內(nèi)。
13. 熒光信號采集階段應(yīng)關(guān)閉實驗室光源，避免環(huán)境光干擾。建議在反應(yīng)板上方加裝遮光罩，特別是使用多通道檢測時。
14. 每次實驗必須設(shè)置NTC（無模板對照）和陽性對照。NTC出現(xiàn)擴(kuò)增曲線時，需排查氣溶膠污染可能性，建議使用含UDG酶的防污染體系。
15. 數(shù)據(jù)分析時采用儀器配套軟件進(jìn)行基線自動校正，手動調(diào)整范圍應(yīng)控制在3-15個循環(huán)之間。對于非典型擴(kuò)增曲線（如鋸齒狀、平臺期不穩(wěn)），需用原始數(shù)據(jù)復(fù)核閾值設(shè)定。
16. 實驗結(jié)束后所有接觸過核酸的耗材需浸泡于10%次氯酸鈉溶液30分鐘，高壓滅菌處理后丟棄。工作臺面需用RNAase去污劑擦拭，紫外線照射30分鐘。
17. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋應(yīng)選擇低吸附離心管，采用"渦旋-瞬時離心"的混勻方式。梯度稀釋時每次更換移液器吸頭，避免產(chǎn)生氣溶膠。
18. 建立實驗記錄追溯體系，包括試劑批號、儀器運行參數(shù)、環(huán)境溫濕度、操作人員等信息。建議對關(guān)鍵步驟進(jìn)行雙人復(fù)核簽字。
19. 定期進(jìn)行室間質(zhì)評，每季度至少參與一次實驗室間比對。當(dāng)Ct值偏差＞1.5時，需啟動儀器維護(hù)程序。
20. 建立異常結(jié)果處理流程：異常應(yīng)重復(fù)檢測，二次異常需更換試劑批次復(fù)檢，三次異常啟動偏差調(diào)查程序并形成書面報告。
